以下是原鑫生物整理的短鏈脂肪酸ELISA試劑盒的完整使用指南，整合操作流程、樣本處理、結果計算及關鍵注意事項。

 一、試劑盒組成與原理  

1. 核心組分（依據）：  

    預包被96孔酶標板（短鏈脂肪酸特異性抗體）  

    凍干標準品（濃度梯度）  

    生物素標記抗體工作液  

    酶標記物工作液（HRP鏈霉親和素）  

    TMB顯色底物（A/B液需1:1混合）  

    終止液（2M硫酸，具腐蝕性）  

    30×濃縮洗滌液（需稀釋至25倍）  

    樣本稀釋液  

   > 檢測原理：雙抗體夾心法。樣本中短鏈脂肪酸與包被抗體結合，再與酶標記物形成復合物，催化底物顯色，OD450nm值與濃度正相關。   

 二、樣本處理規范  

 關鍵步驟：  

| 樣本類型 | 處理步驟 | 保存條件 

| 血清     | 全血室溫靜置2h或4℃過夜 → 1000×g離心20min取上清 | 20℃（≤6個月）或80℃（≤2年） 

| 血漿     | 推薦EDTA抗凝 → 采血30min內4℃、1000×g離心15min | 同血清 

| 組織勻漿 | 1. PBS洗滌 → 稱重；<br>2. 冰上裂解（1g組織+9ml裂解液）→ 超聲/凍融破碎；<br>3. 500010000×g離心10min取上清；<br>4. 測總蛋白（BCA法），調至13mg/ml | 同血清 

| 細胞上清 | 2500rpm離心5min取澄清上清 | 80℃凍存 

| 糞便     | 新鮮采集或80℃保存，稀釋后離心取上清（需預實驗驗證） | 80℃ 

> 裂解液選擇：  

>  避免含NP40、Triton X100、DTT的RIPA（抑制反應）；  

>  推薦50mM Tris + 0.9% NaCl + 0.1% SDS (pH7.3) 。  

> 特殊處理：肝臟/腎臟/胰腺樣本需1% H?O?滅活15min（防內源性過氧化物酶假陽性）。  

 三、操作流程  

 1. 試劑準備  

 洗滌液：30ml濃縮液 + 720ml超純水 → 稀釋25倍（若結晶需40℃水浴溶解）。  

 標準品梯度稀釋：  

   復溶：1ml樣品稀釋液溶解凍干標準品 → 渦旋混勻 → 1000×g離心1min ；  

   稀釋：取7管各加300μl稀釋液 → 按1:2等比稀釋（如300μl原液→1/2管→混勻→取300μl→1/4管…）。  

 生物素抗體工作液：按1:100現配（10μl濃縮液 + 990μl抗體稀釋液）。  

 2. 檢測步驟  

| 順序 | 操作 | 參數 

| 預洗 | 酶標板加洗滌液 → 靜置30s → 棄液（重復2次） | 拍干殘留液 

| 加樣 | 標準品/樣本各50μl → 立即加50μl生物素抗體 | 更換吸頭，混勻1min 

| 孵育1 | 覆膜 → 37℃孵育45min → 洗板3次 | 每次浸泡1min 

| 加酶 | 每孔加100μl酶標物工作液 → 覆膜 → 37℃孵育30min | 洗板5次 

| 顯色 | 加90μl TMB底物 → 37℃避光顯色1020min（密切監控） | 顯藍色梯度 

| 終止 | 加50μl終止液 → 立即測OD值（顏色轉黃） | 15min內完成 

 四、結果計算與驗證  

1. 標準曲線繪制：  

    橫坐標：標準品濃度（如2000~31.25 pg/ml）；縱坐標：平均OD450nm值（復孔）；  

    推薦四參數擬合（4PL） ：避免線性/半對數法的低值壓縮誤差（用Curve Expert或酶標儀自帶軟件）。  

2. 濃度計算：  

    樣本OD值代入曲線方程 → 濃度 × 稀釋倍數；  

    校正讀數：若酶標儀支持，用OD450nm  OD570nm/630nm消除背景干擾。  

 五、關鍵注意事項  

1. 樣本處理：  

    避免溶血/脂血樣本；  

    組織勻漿離心后上清若渾濁，需二次離心或過濾。  

2. 操作細節：  

    全程更換吸頭，分設試劑移液槽（防交叉污染）；  

    顯色時間嚴格控制在20min內（過度顯色導致假陽性）；  

    洗板后充分拍干，防止殘留液體稀釋試劑。  

3. 試劑保存：  

    未開封試劑盒：20℃；開封后酶標板28℃干燥保存，其他組分按說明；  

    終止液（2M硫酸）按危險廢棄物處理。  

4. 質控要求：  

    批內/批間變異系數需＜10%/15%；  

    標準曲線R2 ≥ 0.99。  

 六、常見問題解決  

 顯色異常：  

   無色/弱色：檢查酶標物活性、孵育溫度；  

   全板深藍色：洗板不充分或樣本濃度過高（需稀釋）。  

 標準曲線線性差：復溶不徹底或梯度稀釋操作誤差（渦旋混勻+離心）。  

> 附：流程圖摘要  

> 樣本處理 → 試劑平衡 → 標準品稀釋 → 加樣孵育 → 顯色終止 → 讀數計算  

請以實際短鏈脂肪酸ELISA試劑盒包裝內說明書為準，操作前務必閱讀廠商提供的詳細指南。