bca蛋白含量elisa試劑盒使用方法詳細介紹

一、方法原理與核心步驟  

BCA法基于蛋白質在堿性環(huán)境中將Cu2?還原為Cu?，后者與BCA試劑形成紫色絡合物，其吸光度（OD值）與蛋白濃度成正比，最大吸收峰位于562nm（部分試劑盒支持540595nm范圍） 。

標準流程包括：  

1. 試劑準備：  

    BCA工作液按試劑A:B = 50:1現(xiàn)配現(xiàn)用，混合后需充分混勻（可能出現(xiàn)渾濁）。  

    標準品（如BSA）梯度稀釋（02500 μg/mL），覆蓋試劑盒線性范圍（通常502000 μg/mL）。  

2. 樣品處理：  

    細胞/組織樣品：用PBS或RIPA裂解后離心取上清；血清/血漿需澄清處理 。  

    稀釋至檢測范圍內(nèi)（若ΔA>1.5需預稀釋），避免反復凍融（短期28°C，長期≤20°C）。  

3. 加樣與孵育：  

    96孔板中設置標準孔、樣品孔、空白對照孔，每孔加樣20μl 。  

    孵育條件：  

      傳統(tǒng)法：37℃、3090分鐘（靈敏度120 μg/mL） 。  

      快速法：室溫5分鐘（如Pierce Rapid Gold試劑盒），準確性媲美傳統(tǒng)法 。  

4. 洗滌與顯色：  

    棄液后以洗滌液（350μl/孔）洗板5次 。  

    加TMB底物避光孵育1015分鐘，終止液（如2M硫酸）終止反應 。  

5. OD值讀取：  

    立即在562nm主波長測量（630nm或570nm可作參比波長） 。  

 二、濃度計算與標準曲線繪制  

1. 數(shù)據(jù)處理：  

    計算ΔA（樣品OD  空白OD） 。  

    以標準品濃度（X軸）對應ΔA（Y軸）繪制曲線，推薦四參數(shù)邏輯擬合 。  

2. 濃度換算：  

    代入曲線方程 y = kx + b，乘以稀釋倍數(shù) 。  

    示例：若稀釋10倍后計算濃度為50μg/mL，則實際濃度為500μg/mL。  

 三、關鍵影響因素與優(yōu)化策略  

1. 孵育條件的平衡：  

    速度vs靈敏度：  

| 方法       | 孵育條件       | 檢測限       | 適用場景     

| 傳統(tǒng)BCA        | 37℃、3090min     | 510 μg/mL      | 高精度低濃度樣品           |  

| 快速BCA        | 室溫、5min        | 1 μg/mL         | 高通量篩查、時間敏感實驗   |  

| 增強型BCA      | 60℃、30min        | <5 μg/mL        | 極低濃度樣品               |  

2. 干擾物控制：  

    EDTA：濃度必須<10mM（螯合銅離子導致假陰性） 。  

    還原劑（DTT、β巰基乙醇） ：>1mM時嚴重干擾，建議改用Bradford法或透析去除 。  

    表面活性劑：避免Triton X100、NP40，推薦0.1% SDS替代 。  

 四、誤差排查與質控要點  

1. 常見問題及解決方案：  

   | 問題現(xiàn)象    | 可能原因    | 解決策略     |  

   | 標準曲線線性差        | 標準品降解/配制錯誤           | 現(xiàn)配現(xiàn)用，核對稀釋步驟      |  

   | 樣品OD值超范圍        | 蛋白濃度過高                  | 預稀釋至ΔA<1.5             |  

   | 孔間重復性差          | 加樣不均/洗滌不徹底           | 使用多通道移液器，確保洗板5次  |  

   | 背景值過高            | 樣品中含色素/脂質             | 離心澄清或改用Bradford法    |  

2. 質控實驗：  

    回收率測試：加標已知濃度蛋白，回收率應達90110% 。  

    精密度驗證：室內(nèi)/室間重復檢測CV值<10% 。  

 五、快速BCA法與傳統(tǒng)方法性能對比  

| 參數(shù)   | 傳統(tǒng)BCA法    | 5分鐘快速BCA法     |  

| 孵育時間         | 3090分鐘                   | 5分鐘            |  

| 檢測限           | 510 μg/mL                  | 1 μg/mL         |  

| 線性范圍         | 202000 μg/mL              | 2010000 μg/mL  |  

| 蛋白質間變異系數(shù) | 較高（尤其不同蛋白類型）     | ≤10%             |  

| 適用場景         | 高精度科研                   | 高通量篩選、臨床診斷           |  

> 注：原鑫生物提醒您，快速法在室溫下5分鐘即可達到與傳統(tǒng)法30分鐘相當?shù)娘@色強度，且動態(tài)范圍擴大5倍，但需嚴格控溫（>15℃） 。